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HCT 116, SW 480 세포는 렌티바이러스 감염 8시간 후 24시간 동안 정상 RPMI-1640 배양배지로 유지되었다. 이어서, 세포를 RPMI-1640에서 2 μg/ml 퓨로마이신(Gibco-BRL, 게이더스버그, MD, 미국)으로 배양하였다. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 CHIP 또는 Gal1의 녹다운 및 과발현 효율을 확인하였다(도 1) S1C, S1D). 이 문서에서는 CRC에서 CHIP, Gal1의 역할에 중점을 두고 CHIP이 유비퀴틴화를 통해 Gal1을 저하시고 있다고 설명합니다. 동시에, 우리는 CHIP 또는 Gal1이 CRC의 예후를 별도로 예측할 수 있음을 입증했습니다. 더 흥미롭게도, 이 둘의 결합된 예측은 생존 평가에서 더 많은 정확도를 가진 새로운 예측자로서 시너지 효과를 갖는다. 칩과 갈렉틴-1은 암에서 전이의 발달과 관련이 있다. 그러나 대장암에서 CHIP 또는 Gal1의 정확한 역할은 불확실합니다. 여기에서, 우리의 연구 결과는 CRC에 있는 칩 또는 Gal1의 관계 그리고 임상 중요성을 탐구했습니다. CHIP 또는 Gal1 발현은 CRC 조직 마이크로어레이상면역조직화학에 의한 인접한 비암성 조직과 비교하여 CRC에서 현저하게 감소또는 상하 조절되었다.

낮은 칩 또는 높은 Gal1 발현은 환자의 임상 병리학적 특성뿐만 아니라 전체 생존기간이 짧음과 유의적으로 상관관계가 있다. 다변량 Cox 회귀 분석은 CHIP 또는 Gal1 발현이 CRC 환자를 위한 독립적인 예후 인자였다는 것을 밝혔습니다. 더욱이, Gal1과 관련된 칩은 CRC 예후의 예측에 시너지 효과를 갖는다. 생체외 및 생체내, 높은 칩 또는 낮은 Gal1 발현은 CRC 성장 또는 전이를 억제한다. 우리의 결과는 칩이 유비퀴틴화에 의해 Gal1을 분해할 수 있다는 것을 발견했습니다. 요약하면, CHIP은 프로테아솜에 의한 Gal1 유비퀴틴화 및 분해를 촉진함으로써 CRC 성장 또는 전이를 억제할 수 있었다. CHIP 및 Gal1 식은 CRC에서 새로운 후보 예후 마커입니다. 효율적인 예후 지표로서 CHIP과 Gal1의 결합 된 효과가 처음으로 발견되었습니다. 우리 모두가 알다시피, 칩은 유비퀴틴화에 의해 많은 온코 단백질과 억제 단백질을 분해 할 수있는 E3 리가제입니다. CHIP이 Gal1의 유비퀴틴화를 매개하는지 여부를 조사하기 위해 GAL1과 관련된 모든 단백질을 분해하고 유비퀴틴 분석기를 만들기 위한 IP-서양 실험을 수행했습니다. 우리는 CHIP이 Gal1 단백질의 유비퀴틴화를 크게 촉진한다는 것을 발견했습니다(도 3J). 또한, Gal1의 분해를 위해 CHIP의 유비퀴틴화 함수 도메인이 필요한지 결정했습니다.

LV-CHIP, LV-U-box, LV-TPR의 렌티바이러스를 HCT 116 세포로 형질감염하였다. 결과는 LV-U-box 세포가 LV-CHIP 세포와 동일하게 보편화에 의해 Gal1 수준을 감소시킬 수 있었다는 것을, 그러나 LV-TPR 세포는 아무 효력도 없었다는 것을 표시했습니다 (그림 3K). 모든 결과는 CHIP이 U-box 도메인에 의해 Gal1의 유비퀴틴화를 분해하는 E3 리가제로서 기능하는 것으로 나타났다. 다운로드 : 고해상도 이미지 다운로드 (186KB) 다운로드 : 풀 사이즈 이미지 다운로드 조직에서 CHIP 또는 Gal1의 염색은 임상 데이터를 눈멀게 한 두 병리학자에 의해 득점되었다. 훈련 코호트는 반정량 면역반응성 점수(IRS)에 의해 평가되었고, 다른 곳에서 보고된 바와 같이 [30]. 수신기 연산자 특성(ROC) 분석은 OS의 1, 3 및 5년 동안 곡선(AUC) 하에서 의 영역에 따라 CHIP 또는 Gal-1 IRS의 최적 차단 값을 결정하는 데 사용되었다. CHIP IRS의 최적 차단 점은 생존을 위한 최고의 예측 값을 가졌기 때문에 4로 나타났습니다(도 1) S1A)를 참조하십시오. 이 경우, CHIP 발현은 각각 IRS 0-3 또는 IRS 4-12를 가진 종양 조직에서 낮거나 높은 발현으로 정의된다. 유사하게, Gal1 IRS의 최적 차단점은 6(도 6)인 것으로 나타났다. S1B), IRS 0-5 또는 6-12를 가진 조직은 각각 Gal1의 낮거나 높은 발현으로 분류되었다.

우리는 CHIP이 단백질 수준에서만 Gal1을 부정적으로 조절할 수 있음을 확인했습니다. CHIP이 CRC 세포에서 GAL1을 저하시킬 수 있는 이유를 더 자세히 조사하려면? LV-CHIP CRC 세포 및 상응하는 대조군 세포를 MG132로 처리하였다. 이어서, 웨스턴 블롯은 대조군과 비교하여 Gal1의 수준이 회복되었다는 것을 보여주었다(도 1.